Entwicklung von Massenspektrometrie-basierten Nachweisverfahren für das Erythropoietin-mimetische Peptid Peginesatide im Rahmen der präventiven Dopingforschung - Moeller, I. (Deutsche Sporthochschule Köln, Institut für Biochemie, 2012)
Für Peginesatide, den ersten Vertreter einer neuen Generation Erythropoiese-stimulierender Agenzien, wird ein hohes Missbrauchspotenzial im Leistungssport angenommen. Daher war die Entwicklung von spezifischen und empfindlichen Massenspektrometrie-basierten Nachweisverfahren in verschiedenen, für die Dopinganalytik relevanten Matrices Ziel dieser Arbeit. Dafür wurde zunächst die Struktur des Wirkstoffes identifiziert, bevor dieser synthetisiert und mittels massenspektrometrischer sowie gelelektrophoretischer Verfahren charakterisiert wurde. Da sich die intakte massenspektrometrische Analyse nicht als eindeutiges Nachweisverfahren für die Dopinganalytik eignet, wurde das pegylierte Peptid mithilfe der Serin-Protease Subtilisin in ein proteotypisches Pentapeptid gespalten. Dieses lässt sich empfindlich mit einer Kopplung aus Flüssigkeitschromatographie und Tandem-Massenspektrometrie detektieren, erfüllt die geforderte Sequenzabdeckung und enthält zudem zur weiteren Absicherung des xenobiotischen Ursprungs eine nicht-endogene Aminosäure. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden Nachweisverfahren für Peginesatide in humanem Blut (Serum, Plasma und Blutstropfen), Urin sowie Pferdeserum entwickelt und gemäß internationalen Richtlinien validiert. Die Anwendbarkeit der Methoden wurde schließlich mit authentischen Proben aus einer in vivo Studie an Ratten unter Beweis gestellt, bei der eine therapeutische Dosis von Peginesatide verabreicht wurde und über einen Zeitraum von bis zu vier Tagen Blutstropfen, Urin und Plasmaproben gesammelt wurden. In allen drei Matrices war das charakteristische Pentapeptid nach proteolytischem Verdau bis zum Zeitpunkt der letzten Probennahme, das heißt nach 72 h im Fall der Blutstropfen, beziehungsweise 96 h für Urin und Plasma, eindeutig nachweisbar. Damit stehen im Sinne einer präventiven Dopingforschung bereits zur Erstzulassung des Wirkstoffes in den USA (März 2012) spezifische, empfindliche und valide Nachweismethoden für den Einsatz in der Routinedopinganalytik zur Verfügung, die leicht auch in weiteren Dopingkontrolllaboratorien implementiert werden können und den Nachweis einer (missbräuchlichen) Anwendung von Peginesatide in verschiedenen biologischen Matrices für mindestens einige Tage erlauben.